SQSTM1/p62 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422075-ACT

Das Mausgen *Sqstm1* kodiert SQSTM1/p62, einen multifunktionalen Adapter, der ubiquitinierte Fracht und LC3 bindet, um selektive Autophagie zu koordinieren, einschließlich Aggrephagie und Mitophagie, und dabei zugleich Signalwege der Stressantwort zu integrieren. Über Interaktionen mit KEAP1 moduliert SQSTM1/p62 die NRF2-abhängige antioxidative Transkription, und es fungiert als Scaffold für Signalwege wie NF-κB und mTORC1, die Nährstoffsensorik mit Entzündung und Proteostase verknüpfen. Eine veränderte Menge oder ein veränderter Umsatz (Flux) von SQSTM1/p62 wird häufig als Readout für den autophagischen Turnover genutzt und ist relevant für die Forschung zu Proteinaggregation, oxidativem Stress und Immunsignalisierung bei Neurodegeneration, metabolischer Dysfunktion und in der Krebsbiologie. In Mausmodellen helfen Störungen von *Sqstm1* dabei zu klären, wie Autophagie- und Ubiquitin-Signalgebung die Gewebehomöostase und die Stressadaptation prägen.

SQSTM1/p62 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Sqstm1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SQSTM1/p62 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Sqstm1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Sqstm1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SQSTM1/p62-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Sqstm1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SQSTM1/p62-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SQSTM1/p62-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Sqstm1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.