SPAK CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404440-ACT

Das humane Gen **STK39** kodiert die Serin/Threonin-Kinase **SPAK** (STE20/SPS1-related proline/alanine-rich kinase), einen stressresponsiven Regulator des Ionentransports und der Homöostase des Zellvolumens. SPAK wirkt innerhalb der **WNK–SPAK/OSR1**-Signalachse, um elektroneutrale Kationen-Chlorid-Kotransporter zu phosphorylieren und zu steuern, und beeinflusst damit die epitheliale Salzhandhabung, das neuronale Chloridgleichgewicht und die Anpassung an osmotischen Stress. Durch die Modulation MAPK-gekoppelter Stresssignale und der Phosphorylierungsdynamik von Transportern verknüpft die STK39-Aktivität intrazelluläre Kinase-Netzwerke mit Membrantransportprozessen. Eine Fehlregulation dieses Signalwegs wurde mit veränderter Elektrolytphysiologie in Verbindung gebracht und in Kontexten wie Hypertonierisiko, neurophysiologischer Erregbarkeit und epithelialen Transportphänotypen untersucht.

SPAK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen STK39-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SPAK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des STK39-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der STK39-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SPAK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native STK39-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SPAK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SPAK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem STK39-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.