Smad8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402119-ACT

SMAD9 kodiert Smad8, ein rezeptorreguliertes SMAD-Protein, das Signale der Bone Morphogenetic Proteins (BMP) nachgeschaltet von Serin/Threonin-Kinaserezeptoren vom Typ I/II weiterleitet. Nach Aktivierung der BMP-Rezeptoren wird Smad8 phosphoryliert, bildet Komplexe mit SMAD4 und reichert sich im Zellkern an, wo es Transkriptionsprogramme moduliert, die die Festlegung von Zellschicksalen, Differenzierung und Gewebehomöostase steuern. Von SMAD9 regulierte Outputs des BMP/TGF-β-Signalwegs überschneiden sich mit Entwicklungs-Patterning und osteogenen Gen-Netzwerken, weshalb SMAD9 in Studien zur Skelettbiologie und Linienfestlegung häufig untersucht wird. Eine Fehlregulation der BMP–SMAD-Signalübertragung unter Beteiligung von SMAD9 wurde mit menschlichen entwicklungsbezogenen sowie kardiopulmonalen Phänotypen in Verbindung gebracht und ist allgemein relevant für die Forschung zu Fibrose, Entzündung und Signalgebung in der Tumormikroumgebung, ohne daraus klinische Aussagen abzuleiten.

Smad8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SMAD9-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Smad8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SMAD9-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SMAD9-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Smad8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SMAD9-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Smad8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Smad8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SMAD9-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.