Sec61β CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402791-ACT

SEC61B kodiert Sec61β, eine kleine Untereinheit des heterotrimeren Sec61-Translokons, das in die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) eingebettet ist und den cotranslationalen Proteinimport sowie die Integration von Membranproteinen unterstützt. Durch die Kopplung des Andockens von Ribosomen an das ER und die Koordination mit dem Signal-Recognition-Particle-(SRP)-Signalweg trägt Sec61β zur Proteostase des sekretorischen Systems und zu ER-Qualitätskontrollprozessen bei, die mit der Antwort auf fehlgefaltete Proteine (Unfolded Protein Response, UPR) und dem ER-assoziierten Abbau (ER-associated degradation, ERAD) verknüpft sind. Störungen im translokonabhängigen Transport können die Reifung von Rezeptoren, Kanälen und sezernierten Faktoren beeinflussen, wodurch SEC61B für Studien zu ER-Stress, Proteom-Ungleichgewichten und übergeordneten Mechanismen, die die zelluläre Homöostase prägen, relevant ist. Da der Sec61-Komplex auch die Antigenpräsentation und die Biogenese von Immun- und Stoffwechselregulatoren beeinflusst, wird SEC61B häufig in funktionellen Genomik-Screens untersucht, die Stressanpassung und Phänotypen der Proteinhomöostase adressieren.

Sec61β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SEC61B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Sec61β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SEC61B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SEC61B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Sec61β-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SEC61B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Sec61β-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Sec61β-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SEC61B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.