Sclerostin CRISPR Activation Plasmid (m): sc-428914-ACT

Das murine Sost-Gen kodiert Sclerostin, ein sezerniertes Glykoprotein, das überwiegend von Osteozyten produziert wird und als starker Inhibitor des kanonischen Wnt/β‑Catenin-Signalwegs im Knochen wirkt. Durch Bindung an die Korezeptoren LRP5/6 antagonisiert Sclerostin die durch Wnt-Liganden vermittelte Rezeptoraktivierung und begrenzt damit die Osteoblastendifferenzierung, Matrixablagerung und skelettale Mineralisierung, während es zugleich zur mechanotransduktionsabhängigen Remodellierung beiträgt. Sost ist zudem an der Signalweg-Kreuzregulation mit BMP- und TGF‑β-Signalen beteiligt, die osteogene Genprogramme und die Knochenhomöostase prägt. Eine dysregulierte Sclerostin-Aktivität wird mit veränderten Knochenmassen-Phänotypen in Verbindung gebracht und bietet einen mechanistischen Ansatzpunkt, um Skelettentwicklung, Remodellierung und osteoimmunologisch bedingte Veränderungen des Knochenumbaus zu modellieren.

Sclerostin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Sost-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Sclerostin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Sost-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Sost-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Sclerostin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Sost-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Sclerostin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Sclerostin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Sost-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.