SAP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402165-ACT

APCS kodiert die Serum-Amyloid-P-Komponente (SAP), ein Glykoprotein der Pentraxin-Familie, das calciumabhängig an mikrobielle Polysaccharide, nukleäre Zelltrümmer und Amyloidfibrillen bindet und dadurch die Opsonisierung sowie komplementbezogene angeborene Immunprozesse beeinflusst. SAP ist an Mustererkennung und Clearance-Mechanismen beteiligt, indem es mit Fc-Rezeptoren und Komplementkomponenten interagiert und so inflammatorische Signalwege und die Gewebehomöostase mitprägt. Eine veränderte SAP-Menge oder Bindungsaktivität wurde mit der Biologie der Amyloidablagerung und fehlregulierten Entzündungszuständen in Verbindung gebracht, was APCS zu einem nützlichen Ziel für die Untersuchung extrazellulärmatrix-assoziierter Proteinkomplexe und von Mechanismen der Immunüberwachung macht. In humanen Systemen wird SAP zudem als molekularer Readout für die pentraxinvermittelte Modulation der Bindung löslicher Liganden sowie für den Umgang mit aggregationsanfälligen Proteinen verwendet.

SAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen APCS-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des APCS-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der APCS-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SAP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native APCS-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SAP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SAP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem APCS-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.