RNF213 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-418450-ACT

RNF213 codifica uma grande ligase E3 de ubiquitina do tipo RING finger com atividade de ATPase AAA+ que contribui para a proteostase dependente de ubiquitina e para a remodelação, responsiva ao estresse, da sinalização celular. Em células humanas, a RNF213 tem sido associada à regulação de programas imunes inatos e inflamatórios, incluindo respostas associadas ao interferon, e ao controle de processos vasculares e angiogênicos por meio da modulação do turnover de proteínas e do crosstalk entre vias de sinalização. Variações genéticas e alteração da expressão de RNF213 foram associadas a fenótipos cerebrovasculares e vasculopáticos, incluindo a doença de moyamoya, e têm sido investigadas em contextos de função endotelial e ativação imune. Essas propriedades tornam a RNF213 um alvo relevante para dissecar a sinalização por ubiquitina, a biologia vascular e mecanismos moleculares ligados à inflamação em modelos celulares relevantes para doenças.

RNF213 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RNF213 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RNF213 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RNF213 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RNF213, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RNF213. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RNF213 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RNF213 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RNF213 em células tumorais com expressão de RNF213 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.