RHBDL1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405676-ACT

RHBDL1 (rhomboid-like 1) kodiert eine intramembranäre Serinprotease der Rhomboid-Familie, die in Zellmembranen lokalisiert ist und die Qualitätskontrolle von Proteinen durch proteolytische Prozessierung membranverankerter Substrate reguliert. Indem RHBDL1 den Umsatz ausgewählter Zielproteine beeinflusst, trägt es zu Proteostase‑Signalwegen bei, die sich mit der ER‑assoziierten Degradation, dem Transport von Membranproteinen und stressadaptiver Signalübertragung überschneiden. Eine veränderte Aktivität intramembranärer Proteasen wurde mit fehlregulierter Zellsignalgebung und Proteom‑Remodelling bei Krebs und anderen Erkrankungen in Verbindung gebracht, die durch chronischen zellulären Stress gekennzeichnet sind, wodurch RHBDL1 ein relevantes Ziel für mechanistische Studien darstellt. Die Expressionsdynamik von RHBDL1 kann zudem genutzt werden, um zu untersuchen, wie Membranproteolyse die Reaktionsfähigkeit von Signalwegen in unterschiedlichen humanen Zellkontexten prägt.

RHBDL1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RHBDL1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RHBDL1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RHBDL1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RHBDL1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RHBDL1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RHBDL1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RHBDL1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RHBDL1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RHBDL1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.