Plasmide CRISPR d'Activation (h) RASAL3: sc-404999-ACT

RASAL3 (RAS protein activator like 3) code une protéine activatrice de GTPase Ras qui favorise la conversion de Ras-GTP actif en Ras-GDP inactif, limitant ainsi l’amplitude et la durée de la signalisation dépendante de Ras. Par la régulation négative des voies Ras/MAPK et d’autres voies apparentées de petites GTPases, RASAL3 contribue au contrôle des états d’activation cellulaire, des signaux de prolifération et des programmes transcriptionnels en aval. Son activité est particulièrement pertinente dans les contextes de signalisation des cellules immunitaires, où l’ajustement fin de la voie Ras influence les réponses induites par les récepteurs et la différenciation cellulaire. Une régulation anormale de la voie Ras est impliquée dans divers processus inflammatoires et oncogéniques, faisant de RASAL3 un nœud utile pour des études mécanistiques de l’homéostasie de la signalisation.

RASAL3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RASAL3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RASAL3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RASAL3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RASAL3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RASAL3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RASAL3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RASAL3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RASAL3 dans les cellules tumorales présentant une expression de RASAL3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.