Raptor CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400960-ACT

Das humane RPTOR-Gen kodiert Raptor, eine essenzielle Gerüstkomponente des mTOR-Komplexes 1 (mTORC1), die Substrate wie S6K und 4E-BP1 rekrutiert, um Signale aus Nährstoffverfügbarkeit, Energiehaushalt und Wachstumsfaktoren mit Proteinsynthese, der Unterdrückung der Autophagie und metabolischer Reprogrammierung zu koordinieren. Durch die Regulation von Substratspezifität und Lokalisation von mTORC1 beeinflusst Raptor Zellwachstum, Zellzyklusprogression, Ribosomenbiogenese sowie lysosomenassoziierte Signalübertragung. Eine dysregulierte RPTOR/mTORC1-Aktivität wurde mit veränderter anaboler Signalgebung in der Krebsbiologie, bei Stoffwechselerkrankungen sowie in neuroentwicklungsbezogenen und neurodegenerativen Zusammenhängen in Verbindung gebracht, wodurch es ein häufig genutzter Knotenpunkt zur Analyse von Signalwegen ist. Die Modulation der RPTOR-Expression bietet einen direkten Ansatz, um Rückkopplungen zwischen der PI3K–AKT-Signalgebung, AMPK und nährstoffsensitiven Signalwegen zu untersuchen, die die zelluläre Homöostase prägen.

Raptor Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RPTOR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Raptor Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RPTOR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RPTOR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Raptor-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RPTOR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Raptor-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Raptor-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RPTOR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.