Raptor Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400960-ACT

O RPTOR humano codifica a Raptor, um componente de ancoragem essencial do complexo mTOR 1 (mTORC1) que recruta substratos como S6K e 4E-BP1 para coordenar sinais de nutrientes, energia e fatores de crescimento com a síntese proteica, a supressão da autofagia e a reprogramação metabólica. Por meio da regulação da especificidade e da localização dos substratos do mTORC1, a Raptor influencia o crescimento celular, a progressão do ciclo celular, a biogênese de ribossomos e a sinalização associada a lisossomos. A atividade desregulada de RPTOR/mTORC1 tem sido associada a alterações na sinalização anabólica observadas na biologia do câncer, em doenças metabólicas e em contextos do neurodesenvolvimento e da neurodegeneração, tornando-se um ponto amplamente utilizado para dissecação de vias. Modular a expressão de RPTOR oferece uma abordagem direta para estudar o feedback entre a sinalização PI3K–AKT, a AMPK e as vias de sensoriamento de nutrientes que moldam a homeostase celular.

Raptor O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RPTOR sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Raptor O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RPTOR em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RPTOR, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Raptor. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RPTOR nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Raptor no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Raptor em células tumorais com expressão de RPTOR silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.