Plasmide CRISPR d'Activation (h) RAG-1: sc-401821-ACT

RAG1 code pour RAG-1, une endonucléase spécifique des tissus lymphoïdes, indispensable à l’initiation de la recombinaison V(D)J au cours du développement des lymphocytes B et T, en introduisant des cassures double brin de l’ADN spécifiques de site au niveau des séquences signal de recombinaison. Cette activité couple la diversification des récepteurs de l’antigène aux voies de réponse aux dommages de l’ADN et de réparation, en particulier la jonction d’extrémités non homologues, afin d’assurer l’assemblage productif des loci des immunoglobulines et du récepteur des cellules T. Une fonction de RAG-1 dérégulée ou altérée est associée à une maturation lymphocytaire défectueuse et à une instabilité génomique, reliant la biologie de RAG1 à des phénotypes d’immunodéficience primaire et à des réarrangements chromosomiques aberrants. En tant que gardien de la formation du répertoire immunitaire adaptatif, RAG-1 est largement étudié pour ses rôles dans les mécanismes de clivage programmé de l’ADN, l’accessibilité de la chromatine et la différenciation des cellules immunitaires.

RAG-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAG1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RAG-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAG1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAG1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RAG-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAG1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RAG-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RAG-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de RAG1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.