Rad54B Plasmide KO CRISPR/Cas9 (h): sc-403794

Panoramica

RAD54B codifica Rad54B, un’ATPasi DNA-dipendente della famiglia SWI2/SNF2 che coopera con RAD51 per promuovere la ricombinazione omologa durante la riparazione delle rotture a doppio filamento e la ripartenza delle forcelle di replicazione bloccate. Rimodellando la cromatina e facilitando le fasi di invasione del filamento e migrazione del ramo, Rad54B contribuisce a preservare la stabilità del genoma attraverso la risposta al danno al DNA e programmi di riparazione collegati al checkpoint della fase S/G2. Alterazioni della funzione di RAD54B sono state associate a un’aumentata instabilità cromosomica e a un maggiore carico mutazionale in contesti rilevanti per il cancro, rendendolo un nodo utile per studiare la fedeltà della ricombinazione e i fenotipi legati allo stress replicativo. La perturbazione di RAD54B fornisce inoltre un modello gestibile per analizzare il crosstalk tra ricombinazione omologa, protezione della forcella e vie compensatorie di giunzione delle estremità.

Rad54B Il plasmide CRISPR/Cas9 KO (h) è un pool di plasmidi progettato per la distruzione mirata del gene RAD54B in human linee cellulari. Ogni plasmide del pool co-esprime un sgRNA unico, mirato a un sito distinto all'interno del locus RAD54B, insieme alla nucleasi Cas9 di Streptococcus pyogenes, e codifica per la GFP per consentire l'identificazione fluorescente e l'arricchimento delle cellule trasfettate con successo. Questa strategia multi-guida aumenta la probabilità di indurre spostamenti di lettura o delezioni che producono un knockout funzionale, offrendo un'alternativa più robusta agli approcci a guida singola. Le DSB indotte in più siti vengono risolte tramite giunzione non omologa (NHEJ) o, se utilizzate con il modello donatore HDR incluso, tramite riparazione diretta dall'omologia (HDR) in un sito bersaglio definito all'interno del locus.

Se utilizzato in combinazione con il donatore HDR che esprime RFP, la fluorescenza GFP e RFP può essere utilizzata insieme per distinguere le popolazioni cellulari trasfettate da quelle modificate, semplificando i flussi di lavoro di selezione e selezione dei cloni basati sulla citometria a flusso.

Donatore per riparazione diretta dall'omologia (HDR) — Cassetta puromicina con reporter RFP

Per applicazioni che richiedono cloni knockout confermati e selezionabili, il Rad54B Plasmide HDR (h) include un costrutto donatore HDR contenente una cassetta di resistenza alla puromicina (PuroR) e un reporter proteina fluorescente rossa (RFP), affiancati da bracci di omologia specifici per un sito bersaglio definito RAD54B.
Se cotrasfettato con il Rad54B Plasmide CRISPR/Cas9 KO (h):

• La cassetta PuroR-RFP si integra nel sito di taglio di Cas9 tramite HDR, interrompendo il frame di lettura aperto RAD54B.
  La fluorescenza RFP fornisce un indicatore visivo immediato dell'integrazione riuscita, consentendo l'identificazione o la selezione basata sulla fluorescenza delle cellule modificate prima o parallelamente alla selezione con puromicina.
  Le cellule modificate con successo vengono confermate attraverso la resistenza alla puromicina, riducendo sostanzialmente il carico di screening dei cloni.
  Questa strategia di selezione è ideale per generare linee cellulari KO clonali stabili per studi funzionali a valle, screening farmacologico o sviluppo di modelli.

Sistema di rimozione della cassetta Cre-lox

Il costrutto donatore HDR presenta siti loxP che fiancheggiano la cassetta di selezione PuroR-RFP per consentire la rimozione pulita del marcatore dopo la conferma del clone. L'espressione transiente della ricombinasi Cre tramite il vettore Cre incluso : sc-418923 elimina la cassetta, lasciando un sito loxP residuo minimo all'interno del locus RAD54B ed eliminando potenziali effetti confondenti sui saggi a valle.
Questo approccio in due fasi:

• Riduce al minimo la perturbazione dell'architettura cromatinica locale e degli elementi regolatori adiacenti
  Ripristina un contesto genomico quasi nativo nel locus modificato
  Consente il riutilizzo della strategia di selezione con puromicina nella stessa linea cellulare per ulteriori modifiche

Caratteristiche principali

• gRNA mirato agli esoni RAD54B critici per la funzione Rad54B
  Co-espressione di SpCas9 e sgRNA da un singolo plasmide per una somministrazione semplificata
  Donore HDR con resistenza alla puromicina per la selezione positiva dei cloni
  Cassetta PuroR fiancheggiata da loxP con vettore ricombinasi Cre per la rimozione senza soluzione di continuità del marcatore
  Fornito pronto all'uso per la somministrazione tramite trasfezione

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.