PUMAα/β Plásmido CRISPR/Cas9 KO (h2): sc-400464-KO-2

Descripción general

BBC3 codifica la proteína proapoptótica PUMAα/β, una proteína BH3-only y una diana transcripcional clave de p53 que promueve la permeabilización de la membrana externa mitocondrial al neutralizar a miembros antiapoptóticos de la familia BCL-2 y activar BAX/BAK. Mediante su integración con la señalización de la apoptosis intrínseca, PUMAα/β influye en la liberación de citocromo c, la activación de caspasas y las respuestas celulares al daño del ADN y a otros tipos de estrés. La actividad desregulada de BBC3 está implicada en la biología del cáncer, donde una preparación apoptótica alterada puede afectar la supervivencia y la selección de células tumorales, y también se estudia en contextos de neurodegeneración y lesión isquémica, donde una apoptosis excesiva contribuye a la pérdida de tejido. Como efector nodal de la muerte celular inducida por estrés, BBC3 se utiliza ampliamente para investigar la salida funcional de la vía de p53 y las dependencias de la red BCL-2.

El plásmido CRISPR/Cas9 KO PUMAα/β (h2) es un conjunto de plásmidos diseñado para la interrupción selectiva del gen BBC3 en líneas celulares human. Cada plásmido del conjunto coexpresa un ARN guía específico (sgRNA) único, dirigido a un sitio distinto dentro del locus BBC3, junto con la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes, y codifica GFP para permitir la identificación fluorescente y el enriquecimiento de las células transfectadas con éxito. Esta estrategia multiguía aumenta la probabilidad de inducir desplazamientos de marco de lectura o deleciones que produzcan una inactivación funcional, ofreciendo una alternativa más robusta a los enfoques de guía única. Las DSB inducidas en múltiples sitios se resuelven mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o, cuando se utiliza con la plantilla donante HDR incluida, mediante reparación dirigida por homología (HDR) en un sitio diana definido dentro del locus.

Cuando se utiliza junto con el donante HDR que expresa RFP, la fluorescencia de GFP y RFP puede utilizarse conjuntamente para distinguir las poblaciones de células transfectadas de las editadas, lo que agiliza los flujos de trabajo de clasificación y selección de clones basados en citometría de flujo.

Donante de reparación dirigida por homología (HDR) — Casete de puromicina con reportero RFP

Para aplicaciones que requieren clones knockout confirmados y seleccionables, el plásmido HDR PUMAα/β (h2) incluye un constructo donante HDR que contiene un casete de resistencia a la puromicina (PuroR) y un reportero de proteína fluorescente roja (RFP), flanqueado por brazos de homología específicos de un sitio diana definido BBC3.
Cuando se cotransfecciona con el plásmido PUMAα/β CRISPR/Cas9 KO (h2):

• El casete PuroR-RFP se integra en el sitio de corte de Cas9 mediante HDR, interrumpiendo el marco de lectura abierto BBC3.
  La fluorescencia de la RFP proporciona un indicador visual inmediato del éxito de la integración, lo que permite la identificación o clasificación basada en la fluorescencia de las células editadas antes o junto con la selección con puromicina.
  Las células editadas con éxito se confirman mediante la resistencia a la puromicina, lo que reduce sustancialmente la carga de cribado de clones.
  Esta estrategia de selección es ideal para generar líneas celulares KO clonales estables para estudios funcionales posteriores, cribado de fármacos o desarrollo de modelos.

Sistema de eliminación del casete Cre-lox

La construcción donante HDR cuenta con sitios loxP que flanquean el casete de selección PuroR-RFP para permitir la eliminación limpia del marcador tras la confirmación del clon. La expresión transitoria de la recombinasa Cre a través del vector Cre: sc-418923 incluido extirpa el casete, dejando un sitio loxP residual mínimo dentro del locus BBC3 y eliminando posibles efectos de confusión en los ensayos posteriores.
Este enfoque en dos pasos:

• Minimiza la alteración de la arquitectura local de la cromatina y de los elementos reguladores vecinos
  Restaura un contexto genómico casi nativo en el locus editado
  Permite reutilizar la estrategia de selección con puromicina en la misma línea celular para ediciones adicionales

Características principales

• gRNA dirigido a los exones BBC3 críticos para la función PUMAα/β
  Coexpresión de SpCas9 y sgRNA a partir de un único plásmido para una administración simplificada
  Donante HDR con resistencia a la puromicina para la selección positiva de clones
  Casete PuroR flanqueado por loxP con vector de recombinasa Cre para la eliminación sin fisuras del marcador
  Se suministra listo para su uso mediante transfección

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.