PU.1/Spi1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400547-ACT

SPI1 kodiert PU.1 (Spi1), einen Transkriptionsfaktor der ETS-Familie, der als linienbestimmender Regulator der hämatopoetischen Differenzierung wirkt, insbesondere in myeloiden und B‑Zell-Kompartimenten. PU.1 bindet konservierte ETS-Motive und koordiniert dadurch Transkriptionsprogramme, die die Festlegung von Vorläuferzellen, die Antigenpräsentation, Komponenten der Immunglobulin-Signalübertragung sowie Gene der angeborenen Immunantwort steuern, wobei Signale aus Zytokin- und Wachstumsfaktorwegen integriert werden. Eine veränderte SPI1-Dosierung oder eine Umverdrahtung seines regulatorischen Netzwerks stört die hämatopoetische Homöostase und wird über nachgelagerte Effekte auf Differenzierung, Proliferation und die Expression inflammatorischer Gene mit Leukämogenese und Immunfehlregulation in Verbindung gebracht. Als zentraler Knoten in genregulatorischen Schaltkreisen der Hämatopoese wird PU.1 häufig genutzt, um transkriptionsfaktorgetriebene Zellschicksalsentscheidungen zu modellieren und Enhancer-Promotor-Konnektivität in Immunzellen zu kartieren.

PU.1/Spi1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SPI1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PU.1/Spi1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SPI1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SPI1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PU.1/Spi1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SPI1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PU.1/Spi1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PU.1/Spi1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SPI1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.