PRDM14 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404426-ACT

PRDM14 (PR-domain-Zinkfingerprotein 14) ist ein sequenzspezifischer transkriptioneller Regulator, der in menschlichen Zellen zur Kontrolle von Pluripotenzprogrammen, epigenetischer Reprogrammierung und keimzellassoziierter Genexpression beiträgt. Es beeinflusst den Chromatinzustand durch die Modulation von Histonmarkierungen und der Dynamik der DNA-Methylierung und koordiniert dabei Transkriptionsnetzwerke, die Zellschicksalsentscheidungen und Differenzierung steuern. Die PRDM14-Aktivität überschneidet sich mit Signalwegen, die stammzellähnliche Transkriptionszustände aufrechterhalten und die Linienfestlegung regulieren, was PRDM14 für Studien der Entwicklungsbiologie und der zellulären Reprogrammierung relevant macht. Eine dysregulierte PRDM14-Expression wurde mit veränderten transkriptionellen Schaltkreisen und einem epigenetischen Ungleichgewicht in mehreren Krebs-Kontexten in Verbindung gebracht, was seine Untersuchung als Knotenpunkt in onkogenen, mit „Stemness“ assoziierten Programmen unterstützt.

PRDM14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRDM14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PRDM14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRDM14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRDM14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PRDM14-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRDM14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PRDM14-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PRDM14-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRDM14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.