Pontin 52 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402304-ACT

Humanes RUVBL1 kodiert Pontin 52, eine AAA+-ATPase, die in Multiprotein-Komplexen wirkt, welche die Chromatinarchitektur, die Transkriptionskontrolle und die Biogenese makromolekularer Komplexe regulieren. Pontin 52 ist ein Kernbestandteil des R2TP-Cochaperon-Komplexes und unterstützt die HSP90-abhängige Reifung mehrerer Client-Komplexe, wodurch es mit Prozessen wie DNA-Schadensantworten, Chromatin-Remodeling und der Assemblierung von Ribonukleoproteinen verknüpft ist. Über Interaktionen mit transkriptionellen Regulatoren und Remodeling-Faktoren beeinflusst RUVBL1 die Zellzyklusprogression und stressadaptive Genexpressionsprogramme. Eine fehlregulierte RUVBL1/Pontin-52-Aktivität und veränderte Expression wurden mit proliferativen Signalwegen und Defekten der Genomstabilität in Verbindung gebracht, was es zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien in krebsrelevanten Signalwegen und Proteostase-Netzwerken macht.

Pontin 52 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RUVBL1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Pontin 52 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RUVBL1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RUVBL1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Pontin 52-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RUVBL1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Pontin 52-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Pontin 52-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RUVBL1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.