PMCA2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403416-ACT

ATP2B2 codifica a ATPase de Ca2+ da membrana plasmática na isoforma PMCA2, uma bomba de extrusão de Ca2+ de alta afinidade que mantém baixos os níveis de cálcio citosólico e modula transientes de Ca2+ dependentes de estímulo. Ao acoplar a hidrólise de ATP ao efluxo de Ca2+, a PMCA2 sustenta redes de sinalização dependentes de cálcio que regulam a excitabilidade neuronal, a transmissão sináptica e processos de transporte epitelial. A atividade da PMCA2 interage com vias reguladas por calmodulina, com a sinalização em microdomínios de membrana e com mecanismos homeostáticos de retroalimentação que previnem estresse proteotóxico e mitocondrial induzido por Ca2+. Alterações na expressão ou na função de ATP2B2/PMCA2 têm sido associadas a um manuseio desregulado de cálcio, implicado em fenótipos neurológicos e disfunções do sistema sensorial, reforçando sua relevância para estudos mecanísticos da sinalização por Ca2+.

PMCA2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATP2B2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PMCA2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATP2B2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATP2B2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PMCA2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATP2B2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PMCA2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PMCA2 em células tumorais com expressão de ATP2B2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.