PLUNC Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-416774-ACT

BPIFA1 codifica a PLUNC (clone do epitélio do palato, pulmão e nasal), uma proteína secretada da imunidade inata, enriquecida no epitélio das vias aéreas superiores e no líquido de superfície das vias aéreas. A PLUNC contribui para a defesa do hospedeiro nas mucosas ao modular a atividade antimicrobiana, influenciar a formação de biofilmes e regular a tensão superficial das vias aéreas, bem como a homeostase da barreira epitelial. A expressão de BPIFA1 está ligada a programas de diferenciação epitelial e à sinalização inflamatória no trato respiratório, tornando-a relevante para estudos de inflamação crónica das vias aéreas e da biologia das infeções. Alterações nos níveis de PLUNC têm sido associadas a doenças das vias aéreas caracterizadas por desregulação da imunidade mucosa, incluindo asma, doença pulmonar obstrutiva crónica e rinossinusite crónica.

PLUNC O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de BPIFA1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PLUNC O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus BPIFA1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição BPIFA1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PLUNC. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus BPIFA1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PLUNC no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PLUNC em células tumorais com expressão de BPIFA1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.