PLC β2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400984-ACT

Human PLCB2 kodiert die Phospholipase C beta 2 (PLCβ2), eine phosphoinositid-spezifische Phospholipase, die aktivierte GPCR-Signalwege mit der Bildung von Second Messengern koppelt. PLCβ2 hydrolysiert PIP2 zu IP3 und DAG und fördert dadurch die Mobilisierung von intrazellulärem Ca2+ sowie die Aktivierung von PKC, die Chemotaxis, Degranulation, Zytokinproduktion und weitere Effektorfunktionen regulieren. Dieser Signalweg integriert sich mit PI3K-, MAPK- und Small-GTPase-Signalen und prägt so Zytoskelett-Umbau und Transkriptionsprogramme, insbesondere im Kontext hämatopoetischer und immunologischer Zellen. Eine dysregulierte PLCB2-Aktivität und Ca2+-abhängige Signalgebung wurde mit veränderten Entzündungsreaktionen und onkogenen Signalnetzwerken in Verbindung gebracht, was PLCB2 als mechanistischen Knotenpunkt für die Untersuchung von Signalwegen nützlich macht.

PLC β2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PLCB2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PLC β2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PLCB2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PLCB2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PLC β2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PLCB2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PLC β2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PLC β2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PLCB2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.