plakophilin 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402990-ACT

PKP2 codifica la plakofillina 2, una proteina a ripetizioni armadillo che si localizza nei desmosomi e nei dischi intercalari, dove stabilizza l’adesione cellula-cellula collegando le caderine desmosomiali alle reti del citoscheletro. Attraverso interazioni con desmoplachina, plakoglobina e filamenti intermedi, la plakofillina 2 contribuisce all’integrità delle giunzioni, alla meccanotrasduzione e all’architettura tissutale, in particolare negli epiteli sottoposti a stress meccanico e nei cardiomiociti. La funzione di PKP2 interagisce inoltre con programmi di segnalazione che rispondono allo stato di adesione cellulare e alla tensione del citoscheletro. Alterazioni genetiche e funzionali di PKP2 sono state associate a fenotipi di cardiomiopatia aritmogena e a difetti correlati nella conduzione miocardica e nel rimodellamento strutturale, a supporto della sua utilità come bersaglio negli studi di biologia delle giunzioni cardiache.

plakophilin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PKP2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

plakophilin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PKP2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PKP2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di plakophilin 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PKP2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da plakophilin 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via plakophilin 2 nelle cellule tumorali con espressione di PKP2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.