PKC lambda/iota CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422263-ACT

Prkci kodiert die atypische Protein-Kinase-C-Isoform PKC lambda/iota, eine Serin/Threonin-Kinase, die als zentrale Komponente des PAR-Polarisationskomplexes fungiert und die apikal-basale Polarität, asymmetrische Zellteilung sowie die Organisation von Tight Junctions reguliert. In Mauszellen integriert PKC lambda/iota vorgeschaltete Signale von kleinen GTPasen und der Phosphoinositid-Signalgebung, um Zytoskelettdynamik, Vesikeltransport und gerichtete Migration zu koordinieren. Es moduliert Proliferations- und Überlebenssignale über Signalwege, die mit den transkriptionellen Outputs von PI3K–AKT, NF-κB und Hippo/YAP verknüpft sind, und beeinflusst dadurch Differenzierung und Gewebearchitektur. Eine Fehlregulation der Aktivität atypischer PKCs wurde mit veränderter epithelialer Integrität, gestörter Wachstumskontrolle und entzündungsassoziierten Phänotypen in Verbindung gebracht, wodurch Prkci einen hilfreichen Knotenpunkt für mechanistische Studien in Entwicklungs-, Regenerations- und Krankheitsmodellen darstellt.

PKC lambda/iota Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Prkci-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PKC lambda/iota Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Prkci-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Prkci-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PKC lambda/iota-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Prkci-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PKC lambda/iota-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PKC lambda/iota-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Prkci-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.