PKC beta CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400263-ACT

PRKCB kodiert die Proteinkinase C beta (PKCβ), eine diacylglycerol- und Ca2+-responsive Serin/Threonin-Kinase, die Signale von an die Phospholipase C gekoppelten Rezeptoren weiterleitet. In menschlichen Zellen reguliert PKCβ Phosphorylierungsnetzwerke, die NF-κB- und MAPK-Signalkaskaden, den Umbau des Zytoskeletts, Vesikeltransport sowie Entscheidungen über Zellzyklus und Überleben steuern. Die PRKCB-Aktivität ist eng mit der Signalübertragung über den B‑Zell‑Rezeptor und Fc‑Rezeptoren verknüpft und beeinflusst die Produktion entzündlicher Mediatoren sowie oxidativen Stressantworten. Eine fehlregulierte PKCβ-Signalgebung wurde mit aberranter Immunaktivierung und onkogenen Signalprogrammen in Verbindung gebracht, wodurch PRKCB einen nützlichen Knotenpunkt darstellt, um kontextabhängige Umlenkungen („Rewiring“) von Kinase-Signalwegen zu untersuchen.

PKC beta Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRKCB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PKC beta Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRKCB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRKCB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PKC beta-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRKCB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PKC beta-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PKC beta-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRKCB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.