Peroxin 14 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405075-ACT

PEX14 kodiert Peroxin 14, einen essenziellen Bestandteil der peroxisomalen Importmaschinerie, der die PEX5/PEX7‑Rezeptorkomplexe an der Peroxisomenmembran verankert und so die Translokation von Matrixenzymen ermöglicht. Über seine Funktion in der Peroxisomenbiogenese und im Proteinimport unterstützt PEX14 die β‑Oxidation von Fettsäuren, die Synthese von Etherlipiden und die Entgiftung reaktiver Sauerstoffspezies; damit ist es mit dem zellulären Redoxgleichgewicht und der Lipidhomöostase verknüpft. Störungen des peroxisomalen Imports und der Biogenese stehen mit Peroxisomenbiogenese‑Erkrankungen sowie breiteren metabolischen und neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen in Zusammenhang, wodurch die Regulation von PEX14 für mechanistische Untersuchungen von Organell‑Dysfunktionen relevant ist. In humanen Zellmodellen bietet die Modulation von PEX14 einen gut zugänglichen Ansatzpunkt, um peroxisomenabhängige Signalwege und ihre Wechselwirkungen mit mitochondrialer und inflammatorischer Signalübertragung zu untersuchen.

Peroxin 14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PEX14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Peroxin 14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PEX14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PEX14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Peroxin 14-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PEX14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Peroxin 14-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Peroxin 14-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PEX14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.