periplakin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402350-ACT

Il gene umano **PPL** codifica la periplachina, un citolinker della famiglia delle plakine che collega i filamenti intermedi ai desmosomi e all’involucro corneo, sostenendo la stabilità meccanica di epitelio ed endotelio. La periplachina partecipa all’assemblaggio dei desmosomi, all’organizzazione della rete di cheratine e al rimodellamento del citoscheletro durante la differenziazione e le risposte alle ferite, e può influenzare gli output di segnalazione legati all’adesione cellulare e alle vie di risposta allo stress. Alterazioni dell’espressione o della localizzazione di PPL sono state riportate in diverse patologie epiteliali, incluse malattie infiammatorie della pelle e tumori, in cui sono rilevanti cambiamenti nell’integrità delle giunzioni cellula–cellula e nel comportamento migratorio. In quanto impalcatura alla periferia cellulare, la periplachina è spesso studiata nella formazione della barriera, nella polarità epiteliale e nella regolazione della proliferazione e dell’invasione dipendente dalle giunzioni.

periplakin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PPL senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

periplakin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PPL nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PPL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di periplakin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PPL nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da periplakin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via periplakin nelle cellule tumorali con espressione di PPL silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.