PEPCK-C/PCK1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422131-ACT

Das murine Gen *Pck1* kodiert die zytosolische Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEPCK-C), ein geschwindigkeitsbestimmendes Enzym der Glukoneogenese, das Oxalacetat in Phosphoenolpyruvat umwandelt und TCA‑Zyklus‑Intermediate mit der Glukoseproduktion verknüpft. PEPCK‑C integriert hormonelle und nutritive Signale, um die hepatische Glukosefreisetzung sowie den allgemeinen Kohlenstofffluss durch Glykolyse/Glukoneogenese und anaplerotische/kataplerotische Wege zu koordinieren. Eine veränderte Regulation von *Pck1* wird häufig als molekularer Readout metabolischer Anpassung genutzt, etwa bei Fastenreaktionen, Insulin‑ und Glukagonsignalen sowie Verschiebungen im mitochondrial‑zytosolischen Substrat‑Cycling. Eine fehlregulierte *Pck1*-Expression ist in Mausmodellen mit metabolischen Phänotypen wie Insulinresistenz, hepatischer Steatose und gestörter Glukosehomöostase verbunden.

PEPCK-C/PCK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Pck1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PEPCK-C/PCK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Pck1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Pck1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PEPCK-C/PCK1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Pck1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PEPCK-C/PCK1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PEPCK-C/PCK1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Pck1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.