PDPK1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401731-ACT

Humanes PDPK1 (3‑phosphoinositidabhängige Proteinkinase 1) ist eine zentrale Kinase der AGC-Familie, die Phosphoinositid-Signale mit einer durch Phosphorylierung gesteuerten Kontrolle von Wachstum und Überleben verknüpft. Nachgeschaltet von PI3K wird PDPK1 durch Bindung an PIP3 aktiviert und phosphoryliert wichtige Substrate wie AKT an Thr308 sowie mehrere AGC-Kinasen, darunter S6K, SGK und verschiedene PKC-Isoformen. Dadurch integriert es Signale, die Stoffwechsel, Proteinsynthese, Zellzyklusprogression und Stressantworten regulieren. Über diese Knotenpunkte moduliert PDPK1 mTOR-bezogene Outputs und die Dynamik breiterer Kinase-Netzwerke, die Zellschicksalsentscheidungen und zelluläre Plastizität beeinflussen. Eine fehlregulierte PDPK1-Signalisierung wird häufig im Kontext einer onkogenen Aktivierung des PI3K–AKT-Signalwegs sowie metabolischer Phänotypen untersucht, die für die Krebsbiologie und insulinresponsive Gewebe relevant sind.

PDPK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PDPK1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PDPK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PDPK1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PDPK1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PDPK1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PDPK1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PDPK1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PDPK1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PDPK1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.