PDI CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h): sc-400676

Übersicht

P4HB kodiert die Protein-Disulfid-Isomerase (PDI), eine Thiol-Disulfid-Oxidoreduktase, die während der oxidativen Proteinfaltung im endoplasmatischen Retikulum (ER) die Bildung, Reduktion und Isomerisierung von Disulfidbrücken katalysiert. PDI wirkt innerhalb der ER-Proteostase-Netzwerke, darunter die Unfolded-Protein-Response, der ER-assoziierte Abbau (ERAD) und die chaperonvermittelte Reifung sekretorischer und membranständiger Proteine, und kann über den Austausch von Proteinthiolen zur Redoxsignalgebung beitragen. Eine veränderte P4HB/PDI-Aktivität wurde mit einer gestörten Bewältigung von ER-Stress und einem Redox-Ungleichgewicht in Verbindung gebracht – Prozesse, die an der Anpassung von Krebszellen, metabolischen Funktionsstörungen und Neurodegeneration beteiligt sind. Als zentraler Knotenpunkt der Qualitätskontrolle im sekretorischen Weg wird PDI häufig hinsichtlich seines Einflusses auf faltungsabhängige Signalrezeptoren, Extrazellulärmatrix-Proteine und stressresponsive transkriptionelle Programme untersucht.

PDI CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (h) ist ein Pool von Plasmiden, die für die gezielte Disruption des P4HB-Gens in human-Zelllinien entwickelt wurden. Jedes Plasmid im Pool koexprimiert eine einzigartige sgRNA, die auf eine bestimmte Stelle innerhalb des P4HB-Lokus abzielt, zusammen mit der Streptococcus pyogenes Cas9-Nuklease, und kodiert für GFP, um die fluoreszente Identifizierung und Anreicherung erfolgreich transfizierter Zellen zu ermöglichen. Diese Multi-Guide-Strategie erhöht die Wahrscheinlichkeit, Frameshifts oder Deletionen zu induzieren, die zu einem funktionellen Knockout führen, und bietet damit eine robustere Alternative zu Single-Guide-Ansätzen. An mehreren Stellen induzierte DSBs werden durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder, bei Verwendung mit der enthaltenen HDR-Donor-Matrize, durch homologe Reparatur (HDR) an einer definierten Zielstelle innerhalb des Lokus repariert.

Bei Verwendung in Verbindung mit dem RFP-exprimierenden HDR-Donor können GFP- und RFP-Fluoreszenz gemeinsam genutzt werden, um transfizierte von editierten Zellpopulationen zu unterscheiden, was die auf Durchflusszytometrie basierenden Sortier- und Klonauswahl-Workflows optimiert.

Homology-Directed Repair (HDR)-Donor — Puromycin-Kassette mit RFP-Reporter

Für Anwendungen, die bestätigte, selektierbare Knockout-Klone erfordern, enthält das PDI HDR-Plasmid (h) ein HDR-Donorkonstrukt mit einer Puromycin-Resistenzkassette (PuroR) und einem Reporter für rotes fluoreszierendes Protein (RFP), flankiert von Homologiearmen, die für eine definierte P4HB Zielstelle spezifisch sind.
Bei Co-Transfektion mit dem PDI CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (h):

• Die PuroR-RFP-Kassette integriert sich über HDR an der Cas9-Schnittstelle und unterbricht dabei das P4HB offene Lesegerüst.
  Die RFP-Fluoreszenz liefert einen unmittelbaren visuellen Hinweis auf eine erfolgreiche Integration und ermöglicht die fluoreszenzbasierte Identifizierung oder Sortierung editierter Zellen vor oder parallel zur Puromycin-Selektion.
  Erfolgreich editierte Zellen werden durch Puromycin-Resistenz bestätigt, was den Aufwand für das Klon-Screening erheblich reduziert.
  Diese Selektionsstrategie eignet sich ideal zur Erzeugung stabiler, klonaler KO-Zelllinien für nachgelagerte Funktionsstudien, Wirkstoffscreenings oder die Modellentwicklung.

Cre-lox-Kassetten-Entfernungssystem

Das HDR-Donorkonstrukt verfügt über loxP-Stellen, die die PuroR-RFP-Selektionskassette flankieren, um eine saubere Markerentfernung nach der Klonbestätigung zu ermöglichen. Die transiente Expression der Cre-Rekombinase über das enthaltene Cre-Vektor: sc-418923 schneidet die Kassette heraus, wobei eine minimale Rest-loxP-Stelle innerhalb des P4HB-Lokus verbleibt und potenzielle Störeffekte auf nachgeschaltete Assays eliminiert werden.
Dieser zweistufige Ansatz:

• Minimiert Störungen der lokalen Chromatinarchitektur und benachbarter regulatorischer Elemente
  Stellt einen nahezu nativen genomischen Kontext am editierten Locus wieder her
  Ermöglicht die Wiederverwendung der Puromycin-Selektionsstrategie in derselben Zelllinie für weitere Editierungen

Hauptmerkmale

• gRNA, die auf P4HB Exon(e) abzielt, die für die PDI Funktion entscheidend sind
  Koexpression von SpCas9 und sgRNA aus einem einzigen Plasmid für eine vereinfachte Verabreichung
  HDR-Donor mit Puromycin-Resistenz für die positive Klonselektion
  loxP-flankierte PuroR-Kassette mit Cre-Rekombinase-Vektor für die nahtlose Markerentfernung
  Wird gebrauchsfertig für die Verabreichung durch Transfektion geliefert

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.