PDI CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400676-ACT

Humanes P4HB kodiert die Protein-Disulfid-Isomerase (PDI), eine Thiol-Disulfid-Oxidoreduktase und ein im ER ansässiges Chaperon, das die Bildung, Reduktion und Isomerisierung von Disulfidbrücken katalysiert und damit die oxidative Proteinfaltung unterstützt. PDI ist ein zentraler Bestandteil der Proteostase-Netzwerke des endoplasmatischen Retikulums und trägt zur Signalgebung der unfolded protein response (UPR), zum ER-assoziierten Abbau (ERAD) sowie zur Qualitätskontrolle sekretorischer und membranständiger Proteine bei. Über seine Funktionen in der Redoxhomöostase und als Chaperon beeinflusst PDI zelluläre Antworten auf oxidativen Stress, Hypoxie und metabolische Störungen, die mit Entzündungs- und Überlebenssignalwegen verknüpft sind. Eine fehlregulierte P4HB/PDI-Aktivität und erhöhte Expression werden häufig im Kontext von proteotoxischem Stress und Tumorbiologie untersucht, ebenso wie bei Neurodegeneration und fibrotischem Remodeling, bei denen ER-Stress-Signalwege eine Rolle spielen.

PDI Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen P4HB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PDI Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des P4HB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der P4HB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PDI-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native P4HB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PDI-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PDI-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem P4HB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.