PDI Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400676-ACT

Il gene umano P4HB codifica per la protein disulfide isomerase (PDI), un’ossidoreduttasi tiolo–disolfuro e chaperone residente nel reticolo endoplasmatico (RE) che catalizza la formazione, la riduzione e l’isomerizzazione dei legami disolfuro, supportando il ripiegamento ossidativo delle proteine. La PDI è un componente centrale delle reti di proteostasi del RE, contribuendo alla segnalazione della risposta alle proteine non ripiegate (UPR), alla degradazione associata al RE (ERAD) e al controllo qualità delle proteine secretorie e di membrana. Attraverso i suoi ruoli nell’omeostasi redox e nell’attività di chaperone, la PDI influenza le risposte cellulari allo stress ossidativo, all’ipossia e alle perturbazioni metaboliche, che si intersecano con le vie dell’infiammazione e della sopravvivenza cellulare. L’attività di P4HB/PDI deregolata e l’aumentata espressione sono frequentemente studiate in contesti di stress proteotossico e biologia tumorale, così come nella neurodegenerazione e nel rimodellamento fibrotico, in cui sono implicate le vie dello stress del RE.

PDI Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di P4HB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PDI Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus P4HB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione P4HB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PDI. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus P4HB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PDI nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PDI nelle cellule tumorali con espressione di P4HB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.