Pax-6 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-418357-ACT

PAX6 kodiert Pax-6, einen Paired-Box/Homeobox-Transkriptionsfaktor, der als Masterregulator der Spezifikation neuroektodermaler und okulärer Zelllinien fungiert. Durch Bindung an cis-regulatorische Elemente und die Koordination transkriptioneller Netzwerke mit anderen Entwicklungsregulatoren trägt Pax-6 dazu bei, Zellschicksalsentscheidungen, die Proliferation von Vorläuferzellen sowie Differenzierungsprogramme in Auge, Vorderhirn und den pankreatischen Inselzellkompartimenten zu steuern. Die PAX6-Aktivität ist in übergeordnete Entwicklungssignalwege eingebunden, darunter WNT-, SHH- und TGF-β-assoziierte genregulatorische Schaltkreise, um räumliche Musterbildung und Gewebemorphogenese zu etablieren. Eine Fehlregulation der PAX6-Expression oder -Dosierung ist mit kongenitalen Augenfehlbildungen und neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen verbunden, wodurch PAX6 ein häufig genutzter Knotenpunkt zur Modellierung transkriptioneller Kontrolle in humanen Systemen ist.

Pax-6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PAX6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Pax-6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PAX6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PAX6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Pax-6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PAX6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Pax-6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Pax-6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PAX6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.