PA28β CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403643-ACT

PSME2 kodiert PA28β, eine zentrale Untereinheit des PA28‑(11S)-Proteasomaktivator-Komplexes, der an das 20S‑Proteasom bindet und die ubiquitinunabhängige Peptidverarbeitung fördert. Durch die Beschleunigung des proteasomalen Turnovers und die Prägung von Peptidrepertoires trägt PA28β zur Antigenverarbeitung und zur MHC‑Klasse‑I‑Präsentation bei und verknüpft damit Proteostase mit Immunüberwachung. Diese Aktivität überschneidet sich mit interferonresponsiven Signalwegen, dem Umgang mit oxidativem Stress sowie der Regulation der Proteinqualitätskontrolle im Zytosol und im Zellkern. Eine fehlregulierte Proteasomaktivierung und Antigenpräsentation wurden mit entzündlichen Signalzuständen und der Tumorimmunbiologie in Verbindung gebracht, wodurch PSME2 einen nützlichen Ansatzpunkt für mechanistische Studien in diesen Kontexten darstellt.

PA28β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PSME2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PA28β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PSME2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PSME2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PA28β-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PSME2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PA28β-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PA28β-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PSME2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.