p22-phox CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400325-ACT

CYBA kodiert p22-phox, eine essenzielle membrangebundene Untereinheit des phagozytären NADPH-Oxidase-Komplexes, die die katalytischen NOX-Untereinheiten stabilisiert und den Zusammenbau der für die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) erforderlichen Elektronentransfer-Maschinerie unterstützt. Über NOX-abhängige Redox-Signalgebung trägt p22-phox zur angeborenen Immunabwehr, zur Regulation entzündlicher Signalkaskaden sowie zur Modulation vaskulärer und metabolischer Prozesse bei. Veränderte CYBA-Funktion oder -Expression wurde mit fehlreguliertem oxidativem Stress und entzündlichen Phänotypen in Verbindung gebracht, was für Immundefizienz-Manifestationen sowie für die kardiometabolische und vaskuläre Pathobiologie relevant ist. In humanen Zellen wird CYBA häufig untersucht, um die Regulation des NOX-Komplexes, die kompartimentierte ROS-Produktion und nachgeschaltete Signalereignisse wie die Aktivierung der MAPK- und NF-κB-Signalwege zu analysieren.

p22-phox Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CYBA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

p22-phox Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CYBA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CYBA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen p22-phox-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CYBA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von p22-phox-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des p22-phox-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CYBA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.