OTUD7B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403268-ACT

Das humane OTUD7B-Gen kodiert ein deubiquitinierendes Enzym (mit OTU-Domäne), das Ubiquitinketten spaltet, um die Proteinstabilität und die Stärke von Signalübertragungen fein abzustimmen. OTUD7B wird mit der Regulation von Immun- und Entzündungssignalwegen in Verbindung gebracht, einschließlich der ubiquitinabhängigen Kontrolle von NF-κB und verwandten rezeptornahen Signalkomplexen, und prägt dadurch nachgeschaltete Transkriptionsprogramme. Über seine Wirkung auf die Ubiquitin-Dynamik beeinflusst OTUD7B zelluläre Prozesse wie die Beendigung von Signalen, Stressantworten und die Proteostase. Eine fehlregulierte OTUD7B-Aktivität oder -Expression wurde mit veränderter Immunsignalgebung und krebsrelevanten Phänotypen assoziiert und macht OTUD7B zu einem nützlichen Angriffspunkt für mechanistische Studien zur ubiquitinvermittelten Regulation.

OTUD7B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen OTUD7B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

OTUD7B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des OTUD7B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der OTUD7B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen OTUD7B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native OTUD7B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von OTUD7B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des OTUD7B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem OTUD7B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.