Plasmide CRISPR d'Activation (h) OTUD4: sc-412322-ACT

OTUD4 code une déubiquitinase humaine contenant un domaine « ovarian tumor » (OTU), qui régule le renouvellement des protéines et la signalisation dépendants de l’ubiquitine en retirant des chaînes d’ubiquitine des protéines substrats. En modulant la dynamique de l’ubiquitination, OTUD4 influence la protéostase, les voies de réponse au stress et, selon le contexte, le contrôle de la signalisation innée immunitaire et inflammatoire. D’après la littérature, une activité altérée d’OTUD4 a été associée à une dérégulation des réseaux de signalisation de l’ubiquitine, qui recoupent la stabilité du génome et les décisions de destinée cellulaire, ce qui la rend pertinente pour des études mécanistiques en biologie du cancer et en neurobiologie. Son rôle enzymatique dans la déubiquitination fait également d’OTUD4 un nœud utile pour disséquer les interactions entre le remodelage de l’ubiquitine et les programmes transcriptionnels.

OTUD4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de OTUD4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

OTUD4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus OTUD4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription OTUD4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de OTUD4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus OTUD4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de OTUD4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie OTUD4 dans les cellules tumorales présentant une expression de OTUD4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.