osteopontin/OPN/SPP1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400219-ACT

SPP1 kodiert Osteopontin (OPN), ein sezerniertes Phosphoglykoprotein, das als extrazellulärmatrix-assoziiertes Zytokin wirkt und über die Bindung an Integrine und den CD44-Rezeptor Zelladhäsion, Migration und Überleben beeinflusst. OPN reguliert entzündliche Signalwege und den Gewebeumbau, indem es Leukozyten-Chemotaxis, die Polarisation von Makrophagen und die Aktivität von Osteoklasten koordiniert, und es integriert Signale aus fokalen Adhäsionen und der Zytoskelettdynamik, um Zell-Matrix-Interaktionen zu formen. Die SPP1-Expression ist häufig in Situationen chronischer Entzündung, Fibrose, kardiovaskulären Remodellings sowie im Crosstalk zwischen Tumor und Immunmikroumgebung verändert, wo sie Invasion, Angiogenese und die Rekrutierung von Immunzellen modulieren kann. Diese Eigenschaften machen SPP1 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung extrazellulärer Signalübertragung, Immunregulation und matrixgetriebener Phänotypen in humanen Zellmodellen.

osteopontin/OPN/SPP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SPP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

osteopontin/OPN/SPP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SPP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SPP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen osteopontin/OPN/SPP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SPP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von osteopontin/OPN/SPP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des osteopontin/OPN/SPP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SPP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.