Orai3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403426-ACT

ORAI3 kodiert Orai3, eine Untereinheit eines Ca2+-Freisetzungs‑aktivierten Ca2+-Kanals (CRAC) in der Plasmamembran, die zum store‑operated calcium entry (SOCE) nach Depletion von Ca2+ im endoplasmatischen Retikulum beiträgt. Durch die Formung der zytosolischen Ca2+-Dynamik beeinflusst Orai3 nachgeschaltete Ca2+-abhängige Signalprogramme, darunter NFAT‑getriebene Transkription, Zellzyklusprogression und stimulusgekoppelte Sekretion. Die ORAI3‑Funktion greift in die Interaktion mit STIM‑Proteinen und anderen ORAI‑Familienmitgliedern ein, um Kanalassemblierung und Ionenselektivität fein abzustimmen und dadurch die zelluläre Erregbarkeit sowie Stressantworten zu modulieren. Eine dysregulierte ORAI3‑Expression oder ein SOCE‑Remodeling wurde in der Literatur mit veränderter proliferativer Signalgebung, der Bewältigung von oxidativem Stress und Phänotypen in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie und die Funktion von Immunzellen relevant sind.

Orai3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ORAI3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Orai3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ORAI3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ORAI3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Orai3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ORAI3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Orai3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Orai3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ORAI3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.