Plásmido CRISPR de Activación (h) Orai2: sc-403535-ACT

El ORAI2 humano codifica Orai2, una subunidad central del canal de calcio activado por liberación de calcio (CRAC) que media la entrada de calcio operada por depósitos tras el agotamiento de Ca2+ en el RE. Al controlar el influjo de Ca2+ citosólico, Orai2 ajusta programas de señalización posteriores, incluida la transcripción dependiente de calcineurina–NFAT, la actividad de MAPK y otras vías dependientes de Ca2+ que dan forma a la activación inmunitaria, la secreción y un acoplamiento más amplio entre estímulo y respuesta. La expresión alterada de ORAI2 o el equilibrio de los canales CRAC puede modificar los umbrales de señalización de calcio, contribuyendo a una señalización inflamatoria desregulada, una proliferación celular aberrante y respuestas al estrés dependientes del contexto. En consecuencia, ORAI2 se estudia con frecuencia en modelos de función de células inmunitarias, señalización epitelial y mecanismos que vinculan la homeostasis del Ca2+ con fenotipos relevantes para la enfermedad.

Orai2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ORAI2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Orai2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ORAI2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ORAI2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Orai2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ORAI2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Orai2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Orai2 en células tumorales con expresión de ORAI2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.