OPLAH Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-411939-ACT

OPLAH codifica la 5-ossoprolinasi, un enzima citosolico che converte la 5-ossoprolina (piroglutammato) in L-glutammato in una fase ATP-dipendente del ciclo γ-glutammilico. Attraverso questa reazione, OPLAH contribuisce al turnover del glutatione, all’omeostasi redox cellulare e al metabolismo degli amminoacidi, collegando le risposte allo stress ossidativo con i flussi metabolici mitocondriali e citosolici. Un’alterata attività di OPLAH può perturbare la gestione della 5-ossoprolina e la disponibilità di glutammato, processi rilevanti per fenotipi di stress metabolico e stati di squilibrio redox. Poiché il ciclo γ-glutammilico interseca vie di detossificazione e capacità antiossidante, la regolazione di OPLAH è di interesse negli studi su danno ossidativo, metabolismo associato all’infiammazione e segnalazione neurometabolica.

OPLAH Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di OPLAH senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

OPLAH Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus OPLAH nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione OPLAH, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di OPLAH. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus OPLAH nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da OPLAH nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via OPLAH nelle cellule tumorali con espressione di OPLAH silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.