NSFL1C p47 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402328-ACT

NSFL1C (p47) kodiert ein Adapterprotein, das an die AAA+-ATPase VCP/p97 bindet und dazu beiträgt, diese im Rahmen der ubiquitinabhängigen Qualitätskontrolle von Proteinen gezielt zu bestimmten Substraten zu bringen. NSFL1C p47 ist an Membrantransport sowie an der Dynamik von Golgi-Apparat und ER beteiligt, einschließlich p97‑Cofaktor‑vermittelter Umbaureaktionen, die Vesikelfusion und die Wiederzusammensetzung von Organellen beeinflussen. Über seine Rolle in der Proteostase und in stressantwortenden Abbauwegen wie dem ER‑assoziierten Abbau (ERAD) kann eine veränderte p47‑Funktion die zelluläre Empfindlichkeit gegenüber proteotoxischem Stress sowie den Umbau sekretorischer Kompartimente modulieren. Eine Dysregulation der p97‑Cofaktor‑Achse wird mit Neurodegeneration und krebsassoziierten Proteostase‑Abhängigkeiten in Verbindung gebracht, was NSFL1C zu einem nützlichen Ansatzpunkt für mechanistische Studien dieser Prozesse macht.

NSFL1C p47 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NSFL1C-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NSFL1C p47 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NSFL1C-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NSFL1C-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NSFL1C p47-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NSFL1C-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NSFL1C p47-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NSFL1C p47-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NSFL1C-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.