Plásmido CRISPR de Activación (h) Nkx-6.1: sc-401997-ACT

NKX6-1 codifica el factor de transcripción homeobox Nkx-6.1, un regulador clave del patrón del endodermo pancreático y de la especificación del linaje de las células β. Nkx-6.1 coordina programas transcripcionales que sostienen la diferenciación endocrina, la capacidad secretora de insulina y el mantenimiento de la identidad de las células β mediante interacciones con redes centrales del desarrollo y con la regulación génica impulsada por potenciadores (enhancers). La expresión o función alterada de NKX6-1 se asocia con una maduración deficiente de las células β y una homeostasis de la glucosa desregulada, lo que lo hace relevante para estudios mecanísticos de la susceptibilidad a la diabetes y del fracaso de las células β. Como factor definitorio de linaje, NKX6-1 también se utiliza como marcador y nodo funcional en la diferenciación pancreática derivada de células madre y en las transiciones de estado de las células de los islotes.

Nkx-6.1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de NKX6-1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Nkx-6.1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus NKX6-1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional NKX6-1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Nkx-6.1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo NKX6-1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Nkx-6.1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Nkx-6.1 en células tumorales con expresión de NKX6-1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.