NET-4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404621-ACT

Das humane Gen **TSPAN5** kodiert **NET-4**, ein Membranprotein der Tetraspanin-Familie, das tetraspaninangereicherte Mikrodomänen organisiert und die Zusammensetzung sowie die Signalweitergabe von Partnerrezeptoren an der Zelloberfläche moduliert. Durch das Gerüstbilden von Adhäsions- und Signalkomplexen beeinflusst NET-4 die Zell‑Zell‑Kommunikation, den Membrantransport und Prozesse des Zytoskelett-Remodelings, die die Eigenschaften neuronaler Netzwerke und andere kontextspezifische zelluläre Verhaltensweisen prägen. Eine veränderte Regulation des Tetraspanin-Netzwerks wurde mit Veränderungen der synaptischen Funktion und neuroentwicklungsbedingten Phänotypen in Verbindung gebracht, wodurch TSPAN5 einen nützlichen Ansatzpunkt zur Analyse mikrodomänenabhängiger Signalgebung bietet. Die Regulation von NET-4 ist daher relevant für Studien zur Signalweg‑Kreuzkopplung, Rezeptordynamik und zu Genotyp‑Phänotyp‑Beziehungen in humanen Zellmodellen.

NET-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TSPAN5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NET-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TSPAN5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TSPAN5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NET-4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TSPAN5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NET-4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NET-4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TSPAN5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.