Plásmido CRISPR de Activación (h) NET-4: sc-404621-ACT

El TSPAN5 humano codifica NET-4, una proteína de membrana de la familia de las tetraspaninas que organiza microdominios enriquecidos en tetraspaninas y modula la composición y la salida de señalización de los receptores asociados en la superficie celular. Al actuar como andamiaje de complejos de adhesión y señalización, NET-4 influye en la comunicación célula–célula, el tráfico de membrana y los procesos de remodelación del citoesqueleto que determinan las propiedades de las redes neuronales y otros comportamientos celulares específicos del contexto. La alteración de la regulación de las redes de tetraspaninas se ha vinculado con cambios en la función sináptica y fenotipos del neurodesarrollo, lo que convierte a TSPAN5 en un punto de entrada útil para analizar la señalización dependiente de microdominios de membrana. Por lo tanto, la regulación de NET-4 es relevante para estudios sobre la interconexión (crosstalk) entre vías de señalización, la dinámica de receptores y las relaciones entre genotipo y fenotipo en modelos celulares humanos.

NET-4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TSPAN5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

NET-4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TSPAN5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TSPAN5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de NET-4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TSPAN5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de NET-4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía NET-4 en células tumorales con expresión de TSPAN5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.