nephrocystin-3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406788-ACT

NPHP3 kodiert Nephrocystin-3, ein mit Zilien assoziiertes Protein, das sich in der primären Zilie und im zentrosomalen Bereich lokalisiert und dort zur Ziliogenese, zur zilienabhängigen Signalübertragung sowie zur Aufrechterhaltung der epithelialen Polarität beiträgt. Nephrocystin-3 ist Bestandteil von Proteinkomplexen in der Übergangszone der Zilie, die den Transport von Signalrezeptoren regulieren und Signalwege wie Hedgehog und Wnt beeinflussen, die auf eine intakte Zilienfunktion angewiesen sind. Störungen NPHP3-abhängiger Prozesse können die mechanosensorische und entwicklungsbezogene Signalgebung in renalen und anderen Epithelien beeinträchtigen und verknüpfen seine Erforschung mit Mechanismen von Ziliopathien. Daher ist NPHP3 ein geeignetes Ziel, um in humanen Zellmodellen die zilienvermittelte Signaltransduktion, die Tubulogenese sowie Genotyp-Phänotyp-Zusammenhänge zu untersuchen.

nephrocystin-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NPHP3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

nephrocystin-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NPHP3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NPHP3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen nephrocystin-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NPHP3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von nephrocystin-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des nephrocystin-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NPHP3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.