Plásmido CRISPR de Activación (h) NEPH1: sc-403372-ACT

KIRREL codifica NEPH1, una proteína transmembrana de la superfamilia de las inmunoglobulinas que actúa como componente central del diafragma de hendidura glomerular y contribuye a una adhesión célula‑célula especializada. NEPH1 participa en complejos de señalización que se conectan con el citoesqueleto de actina y con proteínas adaptadoras, lo que sostiene la integridad de la barrera de filtración y la polaridad celular en los podocitos renales. La alteración de la expresión de NEPH1 o su mala localización se relaciona con vías de lesión de podocitos y se ha asociado con fenotipos de enfermedad renal proteinúrica, incluidas formas de síndrome nefrótico. Por ello, KIRREL/NEPH1 se estudia ampliamente en modelos de mantenimiento de podocitos, organización de uniones y remodelación del citoesqueleto bajo estrés.

NEPH1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de KIRREL sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

NEPH1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus KIRREL en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional KIRREL, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de NEPH1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo KIRREL y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de NEPH1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía NEPH1 en células tumorales con expresión de KIRREL silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.