NCOAT CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402329-ACT

MGEA5 kodiert NCOAT (auch bekannt als O-GlcNAcase, OGA), ein bifunktionales Enzym, das O-GlcNAc‑Modifikationen von Serin-/Threoninresten nukleärer und zytoplasmatischer Proteine entfernt und damit als Gegenspieler der O‑GlcNAc‑Transferase den dynamischen O‑GlcNAc‑Zyklus reguliert. Durch die Feinabstimmung der O‑GlcNAcylierung beeinflusst NCOAT die Transkriptionskontrolle, die Chromatinorganisation, die Proteostase und die Signaltransduktion in nährstoff- und stressresponsiven Signalwegen. Eine veränderte O‑GlcNAc‑Homöostase wird mit gestörter metabolischer Signalübertragung, Zellzyklusregulation und neurodegenerativen Prozessen in Verbindung gebracht, wodurch MGEA5 einen relevanten Ansatzpunkt für mechanistische Studien zur zellulären Adaptation darstellt. In menschlichen Zellen kann eine Störung der NCOAT‑Aktivität Netzwerke von Proteinmodifikationen umgestalten, die mit der Insulinsignalgebung und Stressantwort-Programmen verknüpft sind.

NCOAT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MGEA5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NCOAT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MGEA5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MGEA5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NCOAT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MGEA5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NCOAT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NCOAT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MGEA5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.