MTHFD1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403353-ACT

Human MTHFD1 kodiert ein zytosolisches, trifunktionales, folatabhängiges Enzym, das die Umwandlung von 10-Formyl-, 5,10-Methenyl- und 5,10-Methylen-Tetrahydrofolat katalysiert und so Ein-Kohlenstoff-Einheiten bereitstellt, die für die de-novo-Biosynthese von Purinen und Thymidylat sowie für Methylierungsreaktionen benötigt werden. Durch die Kopplung des Folatstoffwechsels an die Nukleotidproduktion unterstützt MTHFD1 die DNA-Replikation und -Reparatur sowie das Fortschreiten des Zellzyklus, insbesondere unter Bedingungen hoher Proliferationsanforderungen. Eine Dysregulation des Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsels wurde mit genomischer Instabilität und veränderten epigenetischen Zuständen in Verbindung gebracht, wodurch MTHFD1 häufig als zentraler Knotenpunkt in metabolischer Umprogrammierung und Stressadaptation untersucht wird. Genetische Varianten oder eine gestörte Expression von MTHFD1 sind zudem mit folatbezogenen Phänotypen und einer erhöhten Anfälligkeit für Erkrankungen assoziiert, bei denen ein gestörtes Nukleotidgleichgewicht und eine eingeschränkte Verfügbarkeit von Methylgruppendonoren eine Rolle spielen.

MTHFD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MTHFD1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MTHFD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MTHFD1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MTHFD1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MTHFD1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MTHFD1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MTHFD1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MTHFD1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MTHFD1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.