MSH3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403422-ACT

Humanes MSH3 kodiert eine zentrale Komponente der DNA-Mismatch-Reparaturmaschinerie, die zusammen mit MSH2 den MutSβ‑Komplex bildet, um Insertion‑Deletions‑Schleifen und andere replikationsassoziierte DNA‑Verzerrungen zu erkennen. Durch die Koordination der Läsionserkennung mit nachgeschalteter Reparatur und Schadenssignalgebung unterstützt MSH3 die Genomstabilität während der S‑Phase und beeinflusst die Aufrechterhaltung von Mikrosatelliten. Eine veränderte MSH3‑Aktivität ist mit einer erhöhten Mutationslast, Mikrosatelliteninstabilität und einer beeinträchtigten Behebung von Replikationsfehlern verbunden – wiederkehrende Merkmale bei mehreren Krebsarten und anderen Erkrankungen der Genomwartung. Die Funktion von MSH3 wird außerdem im Kontext der Wahl von DNA‑Reparaturwegen, von Replikationsstress‑Antworten und von Mutationssignaturen untersucht.

MSH3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MSH3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MSH3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MSH3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MSH3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MSH3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MSH3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MSH3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MSH3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MSH3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.