MRP-S25 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-425723-ACT

Mrps25 kodiert das mitochondriale ribosomale Protein MRP-S25 der Maus, eine Komponente der kleinen Untereinheit des Mitoribosoms, die für die Translation mitochondrienkodierter Untereinheiten der oxidativen Phosphorylierung erforderlich ist. Durch die Unterstützung der mitochondrialen Proteinsynthese trägt MRP-S25 zur Assemblierung der Atmungskette, zur ATP-Produktion und zur Aufrechterhaltung des mitochondrialen Membranpotenzials bei und ist damit mit zentralen bioenergetischen und Proteostase‑Signalwegen verknüpft. Störungen an mitoribosomalen Proteinen können die oxidative Phosphorylierung beeinträchtigen und reaktive Sauerstoffspezies erhöhen – Prozesse, die mit neuromuskulären und metabolischen Phänotypen sowie mit Stressantworten in Zusammenhang stehen, die für den Stoffwechsel von Krebszellen relevant sind. Die Regulation von Mrps25 ist daher für die Untersuchung der Kontrolle der mitochondrialen Translation und der nachgelagerten Effekte auf die zelluläre Fitness von Interesse.

MRP-S25 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Mrps25-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MRP-S25 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Mrps25-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Mrps25-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MRP-S25-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Mrps25-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MRP-S25-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MRP-S25-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Mrps25-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.