Plásmido CRISPR de Activación (h) MRE11: sc-401510-ACT

MRE11 codifica una nucleasa conservada que forma el complejo MRE11–RAD50–NBN (MRN), un sensor y efector central en la reparación de roturas de doble cadena del ADN. A través de sus funciones en el procesamiento de los extremos del ADN, la señalización de los puntos de control ATM/ATR, la recombinación homóloga y el mantenimiento de los telómeros, MRE11 ayuda a preservar la estabilidad del genoma durante el estrés replicativo y ante desafíos genotóxicos. La alteración de la función del MRN se asocia con respuestas defectuosas al daño del ADN, inestabilidad cromosómica y fenotipos vinculados al cáncer, y la actividad de MRE11 se evalúa con frecuencia en estudios de dinámica de la horquilla de replicación y de reparación asociada a la cromatina. En consecuencia, MRE11 constituye un nodo clave para analizar el diálogo cruzado entre vías de la respuesta al daño del ADN (DDR) y los mecanismos de sensibilidad celular frente a perturbaciones que dañan el ADN.

MRE11 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MRE11 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

MRE11 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MRE11 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MRE11, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de MRE11. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MRE11 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de MRE11 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía MRE11 en células tumorales con expresión de MRE11 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.