MGP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401556-ACT

Humanes MGP (Matrix-Gla-Protein) ist ein sezerniertes, vitamin‑K‑abhängiges Protein der extrazellulären Matrix, das vor allem dafür bekannt ist, ektopische Mineralisierung zu hemmen, indem es Calcium bindet und die Ablagerung von Hydroxylapatit reguliert. Es ist für die vaskuläre Biologie hochrelevant, da es osteogene Signalprogramme in vaskulären glatten Muskelzellen moduliert und mit BMP-/TGF‑β‑verwandten Signalwegen interagiert, die Verkalkung, Remodeling und die Homöostase der extrazellulären Matrix steuern. Eine fehlregulierte MGP-Expression oder ein veränderter Carboxylierungsstatus ist mit pathologischen Verkalkungsphänotypen assoziiert, wie sie in kardiovaskulären und bindegewebigen Kontexten beobachtet werden, was MGP zu einem nützlichen molekularen Ansatzpunkt für die Untersuchung von Mechanismen der Verkalkungskontrolle macht. Als zirkulierender und matrixassoziierter Faktor wird MGP zudem als biomarkerbezogenes Gen in mechanistischen Studien des Mineralstoffwechsels und der Gewebealterung genutzt.

MGP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MGP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MGP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MGP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MGP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MGP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MGP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MGP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MGP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MGP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.