Plasmide CRISPR d'Activation (h) MELK: sc-403062-ACT

La kinase à fermeture éclair leucine embryonnaire maternelle (MELK) est une kinase sérine/thréonine impliquée dans la régulation de la progression du cycle cellulaire, le contrôle du point de contrôle mitotique et des programmes transcriptionnels associés à la prolifération. L’activité de MELK a été associée à des phénotypes de type cellule souche, aux réponses au stress cellulaire et à la coordination de la mitose avec les signaux de survie via des voies qui recoupent les réseaux MAPK, les réseaux associés à FOXM1 et d’autres processus régulés par des kinases. Une expression altérée de MELK a été rapportée dans de multiples contextes tumoraux et elle est fréquemment étudiée comme biomarqueur de la capacité proliférative et de la plasticité de lignée. Ces caractéristiques font de MELK un nœud utile pour étudier la régulation de la mitose, l’adaptation métabolique et le remodelage des voies de signalisation dans des modèles cellulaires pertinents pour les maladies.

MELK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MELK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MELK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MELK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MELK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MELK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MELK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MELK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MELK dans les cellules tumorales présentant une expression de MELK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.