Melan-A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-418014-ACT

MLANA kodiert Melan-A, ein Melanozyten-Differenzierungsantigen, das in Melanosomen lokalisiert ist und an der Melanosomenbiogenese sowie an der pigmentbezogenen zellulären Organisation beteiligt ist. Melan-A ist eng mit melanocytären Linienprogrammen verknüpft, die durch transkriptionelle Regulatoren wie MITF gesteuert werden, und wirkt an Signalwegen mit, die die Identität von Melanozyten, die Antigenpräsentation und die Immunerkennung unterstützen. Seine Expression wird häufig genutzt, um melanocytäre Zellen zu stratifizieren und Mechanismen zu untersuchen, die Pigmentierung und zelluläre Differenzierung kontrollieren. Eine fehlregulierte MLANA-Expression wird häufig in der melanocytären Neoplasie untersucht sowie in Kontexten, in denen Melanozyten-Linienmarker Aufschluss über Tumorbiologie und Wechselwirkungen mit dem Immunmikromilieu geben.

Melan-A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MLANA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Melan-A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MLANA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MLANA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Melan-A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MLANA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Melan-A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Melan-A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MLANA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.